IPTG (изопропил-β-D-тиогалактозид) - β-галактозидаза субстратының аналогы, ул югары индукцияләнә. IPTG индукциясе астында индуктор репрессор аксымы белән комплекс барлыкка китерә ала, шуңа күрә репрессор аксымының конформациясе үзгәрә, шуңа күрә ул максатлы ген белән кушылып булмый, һәм максатлы ген нәтиҗәле рәвештә экспрессияләнә. Димәк, эксперимент вакытында IPTG концентрациясен ничек билгеләргә кирәк? Зуррак булган саен яхшыракмы?
Башта, IPTG индукциясе принцибын аңлап алыйк: E. coli'ның лактоза опероны (элементы) өч структураль генны үз эченә ала: Z,Y һәм A, алар β-галактозидаза, пермеаза һәм ацетилтрансферазаны кодлыйлар. lacZ лактозаны глюкоза һәм галактозага, яки алло-лактозага гидролизлый; lacY мохиттәге лактозаның күзәнәк мембранасы аша үтүенә һәм күзәнәккә керүенә мөмкинлек бирә; lacA ацетил төркемен ацетил-КоА'дан β-галактозидка күчерә, бу Токсик эффектны бетерүне үз эченә ала. Моннан тыш, O эшче эзлеклелеге, P башлангыч эзлеклелеге һәм I регулятор ген бар. I ген коды - оператор эзлеклелегенең O позициясенә бәйләнә алган репрессор аксымы, шуңа күрә оперон (мета) басыла һәм сүндерелә. Шулай ук катаболик ген активаторы аксым-CAP бәйләнеш урыны өчен P башлангыч эзлеклелегенең өске өлешендә бәйләнеш урыны бар. P эзлеклелеге, O эзлеклелеге һәм CAP бәйләнеш урыны бергәләп lac оперонының көйләү өлкәсен тәшкил итә. Өч ферментның кодлаучы геннары ген продуктларының координацияләнгән экспрессиясенә ирешү өчен бер үк көйләү өлкәсе белән көйләнә.
Лактоза булмаганда, лак опероны (мета) репрессия халәтендә була. Бу вакытта, PI промоторы эзлеклелеге контролендә I эзлеклелеге белән экспрессияләнгән лак репрессоры O эзлеклелегенә бәйләнә, бу РНК полимеразасының P эзлеклелегенә бәйләнүен булдырмый һәм транскрипция башлануын тоткарлый; лактоза булганда, лак опероны (мета) индукцияләнергә мөмкин. Бу оперон (мета) системасында чын индуктор лактоза үзе түгел. Лактоза күзәнәккә керә һәм β-галактозидаза белән катализлана һәм аллолактозага әйләнә. Соңгысы, индуктор молекуласы буларак, репрессор аксымына бәйләнә һәм аксым конформациясен үзгәртә, бу репрессор аксымының O эзлеклелегеннән һәм транскрипциядән аерылуына китерә. Изопропилтиогалактозид (IPTG) аллолактоза белән бер үк тәэсиргә ия. Ул бик көчле индуктор, ул бактерияләр тарафыннан метаболизмга дучар ителми һәм бик тотрыклы, шуңа күрә ул лабораторияләрдә киң кулланыла.
IPTG оптималь концентрациясен ничек билгеләргә? Мисал итеп E. coli алыйк.
Позитив рекомбинант pGEX (CGRP/msCT) булган E. coli BL21 генетик яктан үзгәртелгән штаммы 50 мкг·мл-1 амперлы LB сыек мохитенә инокуляцияләнде һәм 37°C температурада төнлә үстерелде. Югарыдагы культура киңәйтү культурасы өчен 1:100 нисбәтендә 50 мкг·мл-1 амперлы 10 шешә 50 мл яңа LB сыек мохитенә инокуляцияләнде, һәм OD600 кыйммәте 0,6~0,8 булганда, IPTG соңгы концентрациягә өстәлде. Ул 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 ммоль·л-1 тәшкил итә. Шул ук температурада һәм шул ук вакытта индукциядән соң, аннан 1 мл бактерия эремәсе алынды, һәм бактерия күзәнәкләре центрифугалау юлы белән җыелды һәм төрле IPTG концентрацияләренең аксым экспрессиясенә йогынтысын анализлау өчен SDS-PAGE процессына дучар ителде, аннары иң зур аксым экспрессиясенә ия IPTG концентрациясен сайладылар.
Тәҗрибәләр үткәргәннән соң, IPTG концентрациясенең мөмкин кадәр зур түгеллеге ачыкланачак. Бу IPTG бактерияләр өчен билгеле бер токсиклыкка ия булу белән бәйле. Концентрациядән артып китү күзәнәкне дә үтерәчәк; һәм гомумән алганда, күзәнәктә күбрәк эри торган аксым экспрессияләнгән саен яхшырак дип өметләнәбез, ләкин күп очракларда IPTG концентрациясе артык югары булганда, күп күләмдә кушылмалар барлыкка киләчәк. Тән, ләкин эри торган аксым күләме кими. Шуңа күрә, иң яраклы IPTG концентрациясе еш кына зуррак булган саен яхшырак түгел, ә түбәнрәк була.
Генетик яктан үзгәртелгән штаммнарны индукцияләү һәм үстерүнең максаты - максатлы аксымның уңышын арттыру һәм чыгымнарны киметү. Максатлы генның экспрессиясенә штаммның үз факторлары һәм плазмид экспрессиясе генә түгел, ә башка тышкы шартлар, мәсәлән, индуктор концентрациясе, индукция температурасы һәм индукция вакыты да тәэсир итә. Шуңа күрә, гомумән алганда, билгесез аксым экспрессияләнгәнче һәм чистартылганчы, тиешле шартларны сайлау һәм иң яхшы эксперименталь нәтиҗәләр алу өчен индукция вакытын, температураны һәм IPTG концентрациясен өйрәнү яхшырак.
Бастырып чыгару вакыты: 2021 елның 31 декабре